11. Gentechnische Methoden
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1
Rekombinanten DNA
= künstlich zusammengesetzte DNA
z.B. Plasmide mit Insert
z.B. Plasmide mit Insert
2
Plasmide
= Plasmide sind extrachromosomal vemehrbare meist zikuläre DNA Moleküle
3
Plasmide mit Insert
> Plasmide in welches ein Stück fremde DNA reingebracht wurde
4
Restriktionsenzyme
= Enzyme, die DNA sequenzspezifisch binden und zerscheiden
> Restriktionsenzyme schneiden DNA in Fragmente mit nutzbarer Größe
> viele generieren einzelsträngige "sticky ends", die für die Herstellung von rekombinanter DNA nützlich sind
> Restriktionsenzyme schneiden DNA in Fragmente mit nutzbarer Größe
> viele generieren einzelsträngige "sticky ends", die für die Herstellung von rekombinanter DNA nützlich sind
5
Wie kommt man an DNA ran ?
1. Genomischen DNA isoliert aus Zellen
2. cDNA (Copy DNA, eine Abschrift von RNA als DNA)
3. Künstlich hergestellte DNA (DNA Synthese)
2. cDNA (Copy DNA, eine Abschrift von RNA als DNA)
3. Künstlich hergestellte DNA (DNA Synthese)
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cDNA
Copy DNA
7
Herstellung von cDNA
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EcoRI
> Restriktionsenzyme aus Escherichia coli 
9
Palindrom in DNA Sequenz
> von vorne oben wie von hinten unten gelesen die selbe Basenfolge
> sind Punktsymmetrisch
> sind Punktsymmetrisch
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Wie viele Typen von Restriktionstypen (Restriktionsendonuklease)
3 Typen
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Typ 1 Restriktionsenzyme
> erkennen nicht-palindromische Sequenzen
> schneiden unspezifisch innehalb von ca 1000 bp von der Erkennungsstelle
> schneiden unspezifisch innehalb von ca 1000 bp von der Erkennungsstelle
12
Typ 2 Restriktionsenzyme
> erkennen palindromische Sequenzen
> schneiden idR innerhalb der Erkennungsstelle
> extrem brauchbar für Klonierungen
> schneiden idR innerhalb der Erkennungsstelle
> extrem brauchbar für Klonierungen
13
Typ 3 Restriktionsenzyme
> erkennen nicht-palindromische Sequenzen
> schneiden spezifisch weniger bp stromab der Erkennungsstelle
> schneiden spezifisch weniger bp stromab der Erkennungsstelle
14
BamH1 (Beispiel für Restriktionsenzyme Typ 2)
> Enzym ist eine symmetrisches Dimmer
> Sequenzspezifischer Kontakt in der großen Furche
-> an Erkennungssequenz eng gebunden
-> an beliebiger DNA Sequenz nur locker gebunden
> DNA an Erkennungsstelle leicht gekrümmt
> Sequenzspezifischer Kontakt in der großen Furche
-> an Erkennungssequenz eng gebunden
-> an beliebiger DNA Sequenz nur locker gebunden
> DNA an Erkennungsstelle leicht gekrümmt
15
Wie reguliert E.coli das schneiden bzw nicht schneiden von viraler und eigener DNA durch Restriktionsenzyme?
> eigene DNA wird von EcoM5 methyliert und kann so nicht von EcoR5 geschnitten werden
> virale DNA ist unmethyliert und wird daher an GAT ˋATC von EcoR5 geschnitten
> virale DNA ist unmethyliert und wird daher an GAT ˋATC von EcoR5 geschnitten
16
sticky end
> beim Schneiden von DNA durch Restriktionsenzyme entsteht ein Überhang
> dabei ist am 5´Ende immer ein Phosphat
> und am 3´Ende immer eine OH Gruppe
> dabei ist am 5´Ende immer ein Phosphat
> und am 3´Ende immer eine OH Gruppe
17
blunt end
> beim Schneiden von DNA durch Restriktionsenzyme wird gerade abgeschnitten 
18
Wie schützen sich Bakterien vor ihren eigenen Restriktionsenzymen
> Sie besitzen für jedes Restriktionsenzym ein Modifikationsenzym mit derselben Erkennungssequenz
> diese Modifikationsenzyme Methylieren die Erkennungssequenz sodass restriktionsenzyme nicht mehr schneiden
> diese Modifikationsenzyme Methylieren die Erkennungssequenz sodass restriktionsenzyme nicht mehr schneiden
19
Welche Aussagen sind richtig?
- Am häufigsten werden Restriktionsenzyme vom Typ I verwendet, weil diese DNA sequenzspezifisch schneiden
- Restriktionsenzyme vom Typ II erkennen palindromische Sequenzen, weil sie als symmetrische Dimere arbeiten
- Restriktionsenzyme die einen „sticky-end“ hinterlassen werden in der Molekularbiologie bevorzugt zum Klonieren eingesetzt, weil sich Insert und Vektor über Basenpaarung zusammenlagern können
- Das Restriktionsenzym PstI (CTGCA‘G) erzeugt einen 5‘-Überhang mit der Sequenz 5‘-CTGCA-3‘
- Die Restriktionsenzyme BamHI (G‘GATCC) und Sau3A (‘GATC) erzeugen kompatible 5‘ Überhänge mit der Sequenz 5‘-GATC-3‘
20
Herstellen rekombinanter DNA Moleküle
1.Schritt
> in vitro
> Fragmente erzeugen und Zusammenfügen
2.Schritt
> in vivo
> Erzeugte Vektoren vermehren
> in vitro
> Fragmente erzeugen und Zusammenfügen
2.Schritt
> in vivo
> Erzeugte Vektoren vermehren
21
Welche Aussage ist richtig?
- Die Multiple Cloning Site erhöht die Kopienzahl eines Plasmides in E. coli
- Das Restriktionsenzym EcoRI hat eine definierte 6-bp Erkennungssequenz, die „sticky end“ geschnitten wird
- Manche Restriktionsenzyme führen einen glatten Doppelstrangbruch durch, wie zB das Enzym EcoRV
- Restriktionsenzyme erkennen in der Regel palindromische Sequenzen, so zB ATGGTA
- Erfolgreiche Klonierung eines Inserts kann durch das Ausbleiben von Blaufärbung der Kolonien in Gegenwart von X-Gal sichtbar gemacht werden
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PCR
= Polymerase Chain Reaction (Polymerasekettenreaktion)
> durch PCR kann eine zwischen zwei Primersequenzen liegende DNA spezifisch amplifiziert werden
> so wird Sequenz in vitro synthetisiert
> durch PCR kann eine zwischen zwei Primersequenzen liegende DNA spezifisch amplifiziert werden
> so wird Sequenz in vitro synthetisiert
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Was gehört in einen PCR Ansatz?
- Wasser
- Ligase
- dNTPs
- Polymeras
- RNase
- NTPs