9. Regulation der Transkription in Prokaryoten
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Regulation des Trp Operons
-> Trp Operons ist abhängig von der Tryptophan Konzentration
> Repression (Trp-Repressor repremiert Transkription bei hoher Trp Konzentration)
> Attenuation (durch Kopplung von Transkription mit Translation kommt es zur Termination der Transkription bei hoher Trp Konzentration
> Repression (Trp-Repressor repremiert Transkription bei hoher Trp Konzentration)
> Attenuation (durch Kopplung von Transkription mit Translation kommt es zur Termination der Transkription bei hoher Trp Konzentration
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Aporepressor
unvollständiger Repressor ohne Corepressor
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Holorepressor
vollständiger Repressor mit Corepressor
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Woraus besteht der Holorepressor des Trp-Operons?
> aus Tryptophan welches als Corepressor fungiert
> und dem Trp-Aporepressor welche von trpR codiert wird
> und dem Trp-Aporepressor welche von trpR codiert wird
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Bildung des Trp Holorepressor & Inhibition
> Corepressor = Trp
> bei hoher Trp Konzentration bildet sich der Trp Holorepressor
> nur dann kann das Trp Operons inhibiert werden (es erfolgt keine Translation)
> Inhibition nicht vollständig
> bei hoher Trp Konzentration bildet sich der Trp Holorepressor
> nur dann kann das Trp Operons inhibiert werden (es erfolgt keine Translation)
> Inhibition nicht vollständig
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Welcher wichtige Transkriptionsfaktor befindet sich auf der Leitsequenz de trp-Operons?
der Attenuator
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cis-regulatorisch
= Regulierende Strukturen liegen auf der betreffenden DNA
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trans-regulatorisch
= regulierende Strukturen liegen nicht auf der betreffenden DNA sondern auf einer anderen
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Die Inhibition des Trp Operons erfolgt durch den Trp Holorepressor nur unvollständig, wie wird die Trp Synthese vollständig unterbunden?
= durch Attenuation
> Leitsequenz mit Attenuator
> Translation in mRNA beginnt wird aber durch Termination abgebrochen
> dies erfolgt durch Faltung der mRNA zu einer Haarnadelstruktur (Attenuator Schleife)
> 3: 4 Haarnadel
> Leitsequenz mit Attenuator
> Translation in mRNA beginnt wird aber durch Termination abgebrochen
> dies erfolgt durch Faltung der mRNA zu einer Haarnadelstruktur (Attenuator Schleife)
> 3: 4 Haarnadel
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Zwei Zustände der Leader-Sequenz der Trp mRNA (2 Haarnadelstrukturen)
1)
> Haarnadel 2:3
> Transkription geht weiter
2)
> Haarnadel 3:4
> Transkription stoppt
> Haarnadel 2:3
> Transkription geht weiter
2)
> Haarnadel 3:4
> Transkription stoppt
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Attenuation des Trp Operons
= Termination mit einem Attenuator
> während mRNA Bildung (Transkription), bindet Ribosom und beginnt mit Translation
> Ribosom versucht Leader-Peptid herzustellen
> durch hohe Trp-Konzentration werden die Trp-Codons in Aminosäure übersetzt
> Ribosom kann Leader-Peptid zu Ende Translatieren
> besetzt somit Regionen 1 & 2 auf mRNA
> Regionen 3 & 4 sind unbesetzt & bilden Haarnadelstruktur aus
> Transkription und Translation werden beendet
> während mRNA Bildung (Transkription), bindet Ribosom und beginnt mit Translation
> Ribosom versucht Leader-Peptid herzustellen
> durch hohe Trp-Konzentration werden die Trp-Codons in Aminosäure übersetzt
> Ribosom kann Leader-Peptid zu Ende Translatieren
> besetzt somit Regionen 1 & 2 auf mRNA
> Regionen 3 & 4 sind unbesetzt & bilden Haarnadelstruktur aus
> Transkription und Translation werden beendet
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Anti-Atenuator des Trp Operons
> während mRNA Bildung (Transkription), bindet Ribosom und beginnt mit Translation
> Ribosom versucht Leader-Peptid herzustellen
> durch niedrige Trp-Konzentration werden die Trp-Codons nicht in Aminosäure übersetzt
> Ribosom kann Leader-Peptid nicht weiter Translatieren
> besetzt somit nur Region 1 auf der mRNA
> Regionen 2 & 3 (&4) sind unbesetzt
> 2:3 Haarnadelstruktur bildet sich aus
> es kommt nicht zum Transkriptionsstopp
> Ribosom versucht Leader-Peptid herzustellen
> durch niedrige Trp-Konzentration werden die Trp-Codons nicht in Aminosäure übersetzt
> Ribosom kann Leader-Peptid nicht weiter Translatieren
> besetzt somit nur Region 1 auf der mRNA
> Regionen 2 & 3 (&4) sind unbesetzt
> 2:3 Haarnadelstruktur bildet sich aus
> es kommt nicht zum Transkriptionsstopp
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Was ist ein Leader-Peptid
- Das Hauptprodukt einer mRNA die für mehrere Peptide kodiert
- Ein Vor-Peptid, das nur zur Transkriptionsregulation hergestellt wird
- Der Beginn eines Proteins, der die Stabilität des Proteins reguliert
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Wie kommt es zur Attenuation?
- Bei Tryptophan Mangel stoppt die Translation bereits im Leaderpeptid, so dass die anderen Strukturgene des Trp Operons nicht mehr translatiert werden
- Bei niedrigen [Trp] faltet sich die trp-Leadersequenz in eine Sekundärstruktur, die die Bindung des Ribosoms an die Trp mRNA verhindert
- Bei hohen [Trp] wird ein vollständiges Leaderpeptid hergestellt, wodurch die trp mRNA in eine Transkriptions-Terminations-Struktur faltet, den Attenuator
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Sigma Faktoren
Untereinheiten der RNA-Polymerase
> bringt RNA-Polymerase an die DNA indem der Sigma Faktor den Promotor erkennt
> bringt RNA-Polymerase an die DNA indem der Sigma Faktor den Promotor erkennt
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Regulon
> Bestimmte Sigma Faktoren regulieren ein bestimmtes Set an Genen
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Anti-Sigma-Faktoren
> verhindern durch Binden an der DNA, dass der richtige Sigma-Faktor den Promotor erkennt
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Hitzeschockantwort bei E.coli
bei 30°C
> im Normalzustand wird wenig σH gebildet
> DnaK-DnaJ-GrpE-Chaperon führt σH dem Abbau zu
-> es ist kaum Sigma H vorhanden
bei 42°C also Hitzeschock
> Ribosomenbindestelle für die Trankription von σH liegt frei
> es wird viel σH produziert
> DnaK-DnaJ-GrpE-Chaperon bindet an durch Hitze aufgelöste ungefaltete Proteine
> Chaperon kann nicht mehr an σH binden
> σH setzt die Expression der Hitzeschockgene in Gang
> im Normalzustand wird wenig σH gebildet
> DnaK-DnaJ-GrpE-Chaperon führt σH dem Abbau zu
-> es ist kaum Sigma H vorhanden
bei 42°C also Hitzeschock
> Ribosomenbindestelle für die Trankription von σH liegt frei
> es wird viel σH produziert
> DnaK-DnaJ-GrpE-Chaperon bindet an durch Hitze aufgelöste ungefaltete Proteine
> Chaperon kann nicht mehr an σH binden
> σH setzt die Expression der Hitzeschockgene in Gang
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Wie kommt es nach Hitzeschock zur Expression eines ganzen Sets an Genen, die den entstandenen Schaden wieder reparieren?
- Die Transkription der Reparaturprotein-Gene wird durch ein Aktivator Protein angeschaltet
- Die Translation eines Leaderpeptids wird durch Auflösung der Sekundärstruktur der rpoH mRNA ermöglicht
- Die Reparaturprotein-Gene besitzen eine besondere -35 und -10-Region, die von einem besonderen Sigma Faktor gebunden wird
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Wie viele Bindestellen sind an Genen nötig um den Transkription zu ermöglichen?
> 2
> eine Bindestellen für Sigma Faktor (=Promotor)
> eine Bindestellen für Transkriptionsfaktoren (=Operatoren)
> eine Bindestellen für Sigma Faktor (=Promotor)
> eine Bindestellen für Transkriptionsfaktoren (=Operatoren)
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Operator
> Bindestellen für Transkriptionsfaktoren in der Nähe des Promotors
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Wie wird die Transkription reguliert?
> durch Regulator Proteine
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Repression
> negative Regulation der Transkription durch Repressoren
> Repressor Proteine binden an Operator
> verhindern Bindung der RNA-Polymerase
> Repressor Proteine binden an Operator
> verhindern Bindung der RNA-Polymerase
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Induktion
> Ligand/ Induktor bindet an Repressor
> Repressor mit Induktor kann nicht mehr an DNA binden
> Repressor mit Induktor kann nicht mehr an DNA binden
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allosterisches Zentrum von Repressoren
> Induktor bindet am allosterischen Zentrum vom Repressor
> an anderer Stelle als Stelle mit eigentlicher Aktivität des Repressors
> aber es kommt zur Strukturänderung so dass Repressor nicht an DNA binden kann
> an anderer Stelle als Stelle mit eigentlicher Aktivität des Repressors
> aber es kommt zur Strukturänderung so dass Repressor nicht an DNA binden kann
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Corepression
> manche Repressoren können nur mit einem Ligandem an die DNA binden
> diesen Ligant den nennt man Corepressoren
> Derepression (Corepressor entfernt sich von Repressor)
> diesen Ligant den nennt man Corepressoren
> Derepression (Corepressor entfernt sich von Repressor)
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Aktivatoren
= positiv regulierdende Transkriptionsfaktoren
> manche Aktivatoren können nur mit Liganden an der Operator Region binden
> Wenn Ligand=Protein dann Co-Aktivator
> erleichtern die Bindung der RNA-Polymerase am Operator
> besitzen allosterisches Zentrum
> Aktivator kann nur binden wenn Ligand an allosterisches Zentrum bindet
> manche Aktivatoren können nur mit Liganden an der Operator Region binden
> Wenn Ligand=Protein dann Co-Aktivator
> erleichtern die Bindung der RNA-Polymerase am Operator
> besitzen allosterisches Zentrum
> Aktivator kann nur binden wenn Ligand an allosterisches Zentrum bindet
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Image occlusion: name the hidden labels
29
Image occlusion: name the hidden labels
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3 Strukturgene des Lac Operons
> lacZ
> lacY
> lac A
-> werden durch gemeinsame Promotor- und Operator Region reguliert
> lacY
> lac A
-> werden durch gemeinsame Promotor- und Operator Region reguliert
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Image occlusion: name the hidden labels
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Laktose
Disassharid aus Galactose und Glusose
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Permease und β-Galactosidase
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Welches Enzym wandelt die Laktose in Galaktose und Glucose um ?
Passsiert die Umwandlung direkt ?
Passsiert die Umwandlung direkt ?
β-Galaktosidase
> direkt wenn hohe Konzentration an β-Galaktosidase
> indirekt über Allolactose wenn niedrige Konzentration an β-Galaktosidase
> direkt wenn hohe Konzentration an β-Galaktosidase
> indirekt über Allolactose wenn niedrige Konzentration an β-Galaktosidase
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In welches Disaccharid wird Laktose ,bei niedriger β-Galaktosidase Konzentration in der Zelle, umgewandelt bevor es in die Monosaccharide zerlegt wird ?
> Allolactose
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aus welchen Bestandteilen auf der DNA besteht das Lac-Operon ?
> Promotor
> Operator
> lac-Z
> lac-Y
> lac-A
> Operator
> lac-Z
> lac-Y
> lac-A
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Das lac-Operon wird reguliert über....
(1) Repression / Induktion
- lacI Repressor und Allolactose als Induktor
- repressiert Transkription indem es Bindestellen verbirgt
- gibt Bindestellen frei wenn Induktor bindet
(2) Aktivierung mit Induktor (Co-Aktivator)
- CRP (=camp-receptor-protein) cAMP (=cyclo-Adenosinmonophosphat) als Aktivator
- aktiviert Trankription des lacOperons
(3) Katabilitrepression durch Induktorausschluss
- Anwesenheit von Glucose repressiert die Transkription des lacOperons
- Glucose unterdrückt die Herstellung von cAMP
- hohe Konzentration an Glucose verhindert dass Lactose in die Zelle gelangt
- lacI Repressor und Allolactose als Induktor
- repressiert Transkription indem es Bindestellen verbirgt
- gibt Bindestellen frei wenn Induktor bindet
(2) Aktivierung mit Induktor (Co-Aktivator)
- CRP (=camp-receptor-protein) cAMP (=cyclo-Adenosinmonophosphat) als Aktivator
- aktiviert Trankription des lacOperons
(3) Katabilitrepression durch Induktorausschluss
- Anwesenheit von Glucose repressiert die Transkription des lacOperons
- Glucose unterdrückt die Herstellung von cAMP
- hohe Konzentration an Glucose verhindert dass Lactose in die Zelle gelangt
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Welche drei Elemente sind nötig um die Geregulation zu untersuchen ?
> biochemischer Test, um mRNA oder Protein zu messen
> Bedingungen, an denen die Genexpression im Wildtyp unterschiedlich ist
> Mutationen, die die Genexpression verändern
> Bedingungen, an denen die Genexpression im Wildtyp unterschiedlich ist
> Mutationen, die die Genexpression verändern
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Francois Jacob und Jacques Monod
> untersuchen genregulation in E.coli am Bsp. des lac-Operons
> erfanden den Begriff Operon
> 1961
> erfanden den Begriff Operon
> 1961
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Walter Bilbert und Benno Müller-Hill
> Isolierung des LacI Repressors und des Operators
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Wofür werden die Gene zur lactose Verwertung gebraucht?
> werden nur gegraucht wenn Glucose fehlt und Laktose vorhanden ist
> zur Glucose Gewinnung
> zur Glucose Gewinnung
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LacI
> Lac Repressor
> bindet an den Lac Operator LacO
> bedeckt den Promotor und verhindert die Transkription
> bindet an den Lac Operator LacO
> bedeckt den Promotor und verhindert die Transkription
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Wie kann der Lac Repressor (lacI) vom Operator entfernt werden ?
> durch Allolactose
> fungiert als Induktor
> bindet an das allosterische Zentrum von LacI sodass es den Operator freigibt und die Transkription stattfinden kann
> fungiert als Induktor
> bindet an das allosterische Zentrum von LacI sodass es den Operator freigibt und die Transkription stattfinden kann
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CRP (cAMP Rezeptor Protein)
> bindet als Dimer im Komplex mit cAMP an die große Furche der DNA
> DNA wird dabei um mehr als 90° gebogen
> Aktiviert somit die Transkription des lacOperons
> DNA wird dabei um mehr als 90° gebogen
> Aktiviert somit die Transkription des lacOperons
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cAMP
> cyclo-Adenosinmonophosphat
> ATP wird durch Adenylat Cyclase zu cAMP PPi
> Glucose "hemmt" Vorgang
> wenn wenig Glucose da ist dann steigt cAMP
> Aktiviert die Transkription des lac-Operons
> ATP wird durch Adenylat Cyclase zu cAMP PPi
> Glucose "hemmt" Vorgang
> wenn wenig Glucose da ist dann steigt cAMP
> Aktiviert die Transkription des lac-Operons
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wie beeinflusst die Glucose Konzentration den cAMP-Spiegel
Keine Glucose -> hoher cAMP Spiegel
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Bindestellen des Lac Operons
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Katabolitrepression
Gene deren Proteine für den Abbau eines Nährstoffes benötigt werden, werden durch die Anwesenheit
eines günstigeren Nährstoffes (gewöhnlich Glucose) reprimiert.
> Glucose reprimiert die Transkription des lacOperons
> Glucose reprimiert die Transkription des lacOperons
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Diauxie
> solange Glucose vorhanden ist, wird keine Lactose verwertet
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Wann nimmt die Transkriptionsstärke des Lac Operons ab?
- bei Fehlen des LacI repressors
- bei Fehlen der Adenylatcyclase
- bei fehlen des cAMP Rezeptor Proteins
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ara Operon
> positive und negative Regulation durch AraC
> in Anwesenheit von Arabinose wirkt AraC als Aktivator
> in Abwesenheit von Arabinose wirkt AraC als Repressor
> in Anwesenheit von Arabinose wirkt AraC als Aktivator
> in Abwesenheit von Arabinose wirkt AraC als Repressor
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trp Operon
> gemeinsame Regulation metabolischen Synthesewegen
> trp Operon beeinflusst die Bildung der Enzyme für die Biosynthese von Tryptophan
> trp Operon beeinflusst die Bildung der Enzyme für die Biosynthese von Tryptophan
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Eine E. coli Zelle ist partiell diploid für das Lac operon:
LacI+ LacO+ LacZ- LacY- / LacI- LacO+ LacZ+ LacY+
LacI+ LacO+ LacZ- LacY- / LacI- LacO+ LacZ+ LacY+
- Die Zelle produziert weder β-Galaktosidase noch Permease (nicht induzierbar)
- Die Zelle produziert β-Galaktosidase und Permease nur in Anwesenheit von Lactose (induzierbar)
- Die Zelle produziert β-Galaktosidase und Permease nur in Abwesenheit von Lactose (induzierbar)
- Die Zelle produziert immer β-Galaktosidase und Permease (konstitutiv exprimiert)
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Wann findet erhöhte Tryptophan Biosynthese in Anwesenheit von Tryptophan statt?
- Wenn eine Mutation in trpR vorliegt, die verhindert dass der Trp-Repressor Tryptophan binden kann
- Wenn eine Mutation in trpO vorliegt, die verhindert dass der Trp-Repressor am Operator binden kann
- Wenn eine Mutation in trpA vorliegt, die verhindert, dass aktive Tryptophan Synthase gebildet wird
- Wenn Mutationen in trpL vorliegen, die die Basenpaarung der Bereiche 3 und 4 der trp mRNA verhindern
- Wenn Mutationen in trpL vorliegen, die die Trp-Codons durch Ala-Codons ersetzen